类器官（Organoids）是由干细胞或多能干细胞表现出的三维培养结构，能够在一定程度上模拟真实器官的形态和功能。在生物医学研究中，正确判断类器官的成熟程度以及适时进行传代是确保实验正常进行的关键。本文将分享如何评估类器官的成熟度以及传代的具体流程。

一、评估类器官成熟的标志

1. 形态学观察

类型及形状：成熟的类器官应表现出大小均匀、形状规则的特征。不同类型的类器官具有不同的形态特点，例如肠道类器官通常呈囊状，而脑类器官可能呈现神经球状结构。一般来说，正常肠道类器官在培养12-14天后适合进行传代。

结构复杂性：成熟的类器官应展现出与真实器官相似的分层或分区特征，包括肠道类器官的隐窝-绒毛结构和脑类器官的皮层样分层。这些特征均可通过显微镜观察判断。

2. 细胞组成

细胞类型多样性：成熟的类器官应包含多种细胞，例如肠道类器官应具含肠上皮细胞、杯状细胞及潘氏细胞等。可采用免疫荧光染色或流式细胞术检测特定标志物（如Lgr5+干细胞、MUC2+杯状细胞）。

细胞分化程度：成熟类器官中的细胞应表达特定的成熟标志物，如肠道类器官中的Villin或脑类器官中的NeuN等。蛋白质免疫印迹（WB）可用来检测标志物的表达情况。

3. 功能检测

分泌功能：验证类器官如肠道类器官是否具有分泌功能，例如分泌黏液或激素。

电生理活性：对于神经类器官，可以通过膜片钳技术评估神经元的电活性。

代谢活性：检测类器官的代谢功能，如ATP生成与氧气消耗率。

预期功能：类器官是否具备其预期功能，例如肠道类器官的CFTR活性及心脏类器官是否能够自主跳动等。

4. 基因表达分析

qPCR或RNA测序可用于检测类器官中与成熟相关的基因表达水平，例如肠道类器官中的分化标志物和脑类器官的特异性基因。同时，表观遗传状态如DNA甲基化水平也可以评估类器官是否接近体内成熟组织。

二、类器官传代流程

1. 判断何时进行传代

类器官生长速率：当类器官直径达到200-500μm或生长速度明显减慢时，通常需要进行传代。

培养基消耗：培养基变黄时也表明需要传代。

类器官结构变化：若观察到类器官结构变异或中心坏死现象，应及时进行传代。

2. 传代步骤

收集类器官：轻轻用移液器吹打培养基，将类器官从基质胶中释放并转移至离心管中。

消化类器官：添加适量消化酶，轻轻吹打类器官以使其解离为小细胞团或单细胞，消化时间根据类器官类型和酶浓度，通常为5-15分钟。

终止消化：加入含血清的培养基以终止消化反应，并用移液器轻轻分散细胞团。

离心与重悬：300-500g离心5分钟弃上清后，用新鲜培养基重悬细胞团。

重新接种：将细胞团与基质胶混合，接种至预热的培养板中，待基质胶凝固后，加入类器官培养基。

培养：将培养板放入37°C、5%CO₂培养箱继续培养。

注意事项

1. 消化时间控制：消化时间过长可能导致细胞损伤，过短可能使类器官解离不完全。

2. 基质胶质量：使用高品质基质胶，确保其均匀分布。

3. 培养基优化：选择合适的培养基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生长因子）以支持类器官的正常分化。

4. 防控污染：严格执行无菌操作以避免类器官受到污染。

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