尊龙凯时邀请您了解IPS诱导肠类器官的培养过程。本篇将细分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化，以及中/后肠的模式诱导和类器官的培养。接下来，我们将重点讨论第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：
（1）将hPSCMediumSupplement在2-8℃下解冻，融化后上下轻轻晃动均匀，按实际需求进行分装，建议立即使用或储存于-20~-80℃以避免反复冻融。
（2）将10mL的hPSCMediumSupplement按1:50的比例加入500mL的hPSCMediumBasalMedium中，混合均匀后即成为人多能干细胞培养基（abs9403）。请注意，混匀后的人多能干细胞培养基可在2-8℃下稳定存放2-3周，但不建议使用超过3周的培养基。
（3）试剂预热：实验前将人多能干细胞培养基放置在室温下避光平衡；PBS和消化液需加热至37℃。请勿将培养基置于37℃水浴中加热，以免影响因子的活性。

二、操作方法

在无菌条件下进行以下操作：
1. hPSC细胞复苏：
    （1）基质胶的包被：取出6孔板或12孔板，每孔添加1mL或0.5mL的基质胶（abs9410），轻轻晃动使其完全覆盖皿底，放置于37℃培养箱孵育1-2小时，之后在超净工作台中平衡20分钟。如暂不使用，可用Parafilm密封后在2-8℃下保存，建议在1周内使用。注意：每支冻存的干细胞约为1×10^6 cells/mL，适合对应6孔板的一个孔使用；基质胶对温度敏感，使用后应立即放回4℃冰箱，避免手直接触碰胶液，以确保其质量。

    （2）将2~3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。
    （3）解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中并快速摇动，使其在1-2分钟内解冻完成。注意：需迅速操作，尽量缩短细胞暴露在室温的时间。
    （4）离心：解冻后的生物样本逐滴加入含有干细胞培养基的离心管中，然后以低速离心机1000rpm离心3分钟。
    （5）重悬：离心后弃去上清液，加入1mL人多能干细胞培养基，对沉淀进行轻柔的吹打混匀，吸吹3-5次。
    （6）接种：将均匀的干细胞悬液加入已经包被的6孔板中，每孔补全至2mL培养体系。
    （7）培养：接种后的6孔板可放于倒置相差显微镜下观察细胞密度，细胞团块大小需在四个细胞以上。轻轻摇动6孔板以确保细胞分布均匀，并于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。第2天观察细胞贴壁情况。
    （8）换液：从复苏开始，每24小时更换培养基一次，因为培养基中的活性成分仅能维持一天，所以需及时更新。

三、多能干细胞(PSCs)的传代

具体步骤如下：
21. 清洗：吸去原有的培养基，沿边缘加入1mL PBS缓冲液轻轻晃动后去除。

22. 消化：在6孔板中加入2mL人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中消化2-5分钟，根据细胞生长密度及消化情况灵活调整时间。
23. 吹打：移去消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪轻柔吹打培养皿以激活细胞脱落，并转移至15mL离心管中。注意：控制吹打力度，避免形成单细胞聚集。
24. 离心：1000rpm离心3分钟并弃去上清。
25. 接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞，再用其将细胞悬液加入培养板，补全每孔2mL的培养体系。注意：吹打细胞要温柔，并且吹打次数不得超出10次。
26. 换液：从传代开始，每24小时更换培养基一次，以保证细胞能持续获得新鲜营养。

最后，关于多能干细胞的冻存：
31. 清洗和消化步骤同前，随后进行吹打和离心。
32. 将2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412）加入干细胞沉淀中，轻柔吹打均匀后装入冻存管中。注意冻存液需即用即拿，及时放回4℃冰箱。
33. 在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者及批次。
34. 放置在-80℃冰箱中冻存，确保冻存管直立放置。
35. 24小时后将细胞转移至液氮中进行长期冻存。

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